單克隆抗體制備是基于B淋巴細胞能夠產(chǎn)生特異性抗體以及腫瘤細胞具有無限增殖特性這兩大關(guān)鍵生物學(xué)特性而發(fā)展起來的復(fù)雜但精巧的技術(shù)體系。其核心流程主要包含以下幾個關(guān)鍵步驟：
 

　　(一)免疫動物
 

　　選擇合適的抗原對特定的動物(如小鼠、大鼠等)進行免疫接種。通常，抗原需要具備良好的免疫原性，能夠有效刺激機體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答。在多次免疫接種后，動物體內(nèi)的B淋巴細胞會識別抗原并啟動體液免疫反應(yīng)，大量增殖分化為漿細胞和記憶細胞。漿細胞能夠合成并分泌針對該抗原的特異性抗體，而記憶細胞則可在再次遇到相同抗原時迅速啟動免疫反應(yīng)，產(chǎn)生更強的抗體應(yīng)答。
 

　　(二)細胞融合
 

　　從經(jīng)過免疫的動物脾臟中分離出已致敏的B淋巴細胞，這些B淋巴細胞能夠分泌針對特定抗原的抗體，但它們在體外的培養(yǎng)條件下難以長期存活和大量增殖。與此同時，選取合適的骨髓瘤細胞，這類細胞具有在體外培養(yǎng)條件下可無限增殖的特性，但不能分泌特異性抗體。然后，通過特定的融合劑(如聚乙二醇，PEG)將B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行融合，形成雜交瘤細胞。這種雜交瘤細胞既繼承了B淋巴細胞分泌特異性抗體的能力，又具備了骨髓瘤細胞無限增殖的特性，從而能夠在體外持續(xù)培養(yǎng)并大量擴增。
 

　　(三)篩選與克隆化培養(yǎng)
 

　　在細胞融合后，會得到多種類型的細胞混合體系，包括未融合的B淋巴細胞、骨髓瘤細胞以及雜交瘤細胞等。由于B淋巴細胞和骨髓瘤細胞在體外培養(yǎng)條件下不能長期存活或單獨增殖，所以需要通過特定的選擇性培養(yǎng)基來篩選出雜交瘤細胞。常用的培養(yǎng)基是HAT培養(yǎng)基，其中含有次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)。在這種培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細胞由于缺乏次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)而不能利用補救途徑合成核酸，會死亡；而未融合的B淋巴細胞本身不能在體外長期存活。只有雜交瘤細胞由于從B淋巴細胞處獲得了HGPRT基因，能夠在HAT培養(yǎng)基中存活并增殖。
 

　　篩選得到的雜交瘤細胞可能并非都是分泌所需特異性單克隆抗體的細胞克隆，因此需要進一步進行克隆化培養(yǎng)。通過有限稀釋法等技術(shù)，將雜交瘤細胞稀釋到較低的密度，接種到多孔培養(yǎng)板中，使每個孔內(nèi)理論上只有一個雜交瘤細胞。在適宜的培養(yǎng)條件下，單個細胞會增殖形成細胞克隆。然后，通過檢測各細胞克隆上清液中抗體的特異性和活性，篩選出能夠分泌所需單克隆抗體的陽性克隆，并進行擴增培養(yǎng)，從而獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
 

　　(四)單克隆抗體制備方法
 

　　將篩選得到的陽性雜交瘤細胞株進行大規(guī)模培養(yǎng)，根據(jù)培養(yǎng)方式的不同，可以分為體內(nèi)培養(yǎng)和體外培養(yǎng)兩種方法。體內(nèi)培養(yǎng)通常是將雜交瘤細胞接種到同源的動物腹腔內(nèi)，在動物體內(nèi)生長并產(chǎn)生腹水，腹水中含有高濃度的單克隆抗體，然后通過抽取腹水并經(jīng)過純化處理即可獲得單克隆抗體。體外培養(yǎng)則是在生物反應(yīng)器等適宜的體外培養(yǎng)系統(tǒng)中，為雜交瘤細胞提供合適的營養(yǎng)物質(zhì)、氣體環(huán)境等條件，使其大量增殖并分泌單克隆抗體，再通過一系列的蛋白質(zhì)純化技術(shù)，如鹽析、離子交換層析、親和層析等，從細胞培養(yǎng)上清液中提取和純化出高純度的單克隆抗體。